SCIEX液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)測(cè)定微量血中的脂溶性維生素

引言 
        脂溶性維生素(Liposoluble Vitamins) 包括維生素A、維生素D、 維生素E、維生素K，不溶于水而溶于脂肪及有機(jī)溶劑，由長的碳 氫鏈或稠環(huán)組成的聚戊二烯化合物。維生素是維持身體健康所必需 的一類有機(jī)化合物。這類物質(zhì)在體內(nèi)既不能是構(gòu)成身體組織的原 料，也不是能量的來源，而是一類調(diào)節(jié)物質(zhì)，在物質(zhì)代謝中起重要 作用。維生素A：維持正常視覺，維持上皮細(xì)胞、組織完整，增強(qiáng) 機(jī)體免疫力，參與鐵代謝；維生素E：抗氧化、清除自由基，保護(hù) 神經(jīng)功能，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，維持正常生育功能；維生素D：維持 骨骼發(fā)育，調(diào)節(jié)抗原提呈細(xì)胞的分化、淋巴細(xì)胞的增值，影響免疫 力、智力發(fā)育；維生素K：參與凝血因子的合成，參與骨鈣素的合 成。 
        本方法采用液液萃取方法對(duì)生物樣本進(jìn)行前處理，然 后SCIEX液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)系統(tǒng)，以待測(cè)目標(biāo)物的同位素 標(biāo)記物為內(nèi)標(biāo)，檢測(cè)人血清中維生素A (VA)、25-羥基維生素 D2（25OHVD2）、25-羥基維生素D3（25OHVD3）、維生素E （VE）、維生素K1 (VK1)。

實(shí)驗(yàn)部分
        樣品處理：向1.5 mL EP管中，依次加入10 μL內(nèi)標(biāo)工作液(表 2)、50 μL全血和140 μL甲醇；渦旋20秒，混勻；再加入0.6 mL正己 烷，3,000 r/min渦旋100 s，然后10,000 rpm離心3分鐘；取離心后 的上清液，在氮?dú)庀麓蹈?。殘?jiān)?00 μL 80%甲醇復(fù)溶、離心， LC-MS/MS進(jìn)樣20 μL分析。 

色譜條件：        
        色譜柱使用Phenomenex kinetex C18 column (50×3.0 mm, 2.6 μm）進(jìn)行分離，流動(dòng)相選用水（含0.1% 甲酸）作為A相，和 甲醇（含0.1% 甲酸）作為B相，柱溫設(shè)為40 ℃，進(jìn)樣量為20 μL； 進(jìn)行梯度洗脫，液相梯度見表2。
 

質(zhì)譜條件：
        使用SCIEX TripleQuad™ 4500MD質(zhì)譜系統(tǒng)。采用Heated Nebulizer（APCI）和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（Multiple Reaction Monitoring， MRM）模式進(jìn)行質(zhì)譜掃描。離子源參數(shù)：加熱氣（GS1）為 60 psi，脫溶劑氣溫度為550 ℃；氣簾氣（Curtain Gas，CUR） 為35 psi，碰撞氣（Collision Gas，CAD）為6 psi；霧化器電流 （Nebulizer Current, NC)：5 μA。為了獲取較好的穩(wěn)定性和靈敏度，各化合物監(jiān)測(cè)離子對(duì)的去簇電壓（Declustering Potential， DP）和碰撞電壓（Collision Energy，CE），目標(biāo)物定量離子對(duì)、定 性離子對(duì)以及內(nèi)標(biāo)物監(jiān)測(cè)離子對(duì)等參數(shù)均經(jīng)過系統(tǒng)優(yōu)化，離子對(duì)信 息見表3。
 

結(jié)果與討論
        圖1 VA、25OHVD2、25OHVD3、VE和VK1在定量下限LOQ提 取離子流圖。圖2是人全血中VA、25OHVD2、25OHVD3、VE和 VK1的提取離子流色譜圖，峰型對(duì)稱，響應(yīng)良好。
        VA、25OHVD2、25OHVD3、VE和VK1回歸方程和線性范圍見 表3，VA、25OHVD2、25OHVD3、VE和VK1在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi) 線性良好，r均大于0.996。
 

        為了考察方法的重現(xiàn)性及準(zhǔn)確性，分別進(jìn)行VA、25OHVD2、 25OHVD3、VE和VK1的精密度(RSD)和準(zhǔn)確度方法驗(yàn)證。從表4可以 看出，VA、25OHVD2、25OHVD3、VE和VK1低、中、高濃度的精 密度均在10%以內(nèi)，準(zhǔn)確度均在88-108%之內(nèi)。
 

總結(jié)
本方法使用SCIEX 高靈敏度和高穩(wěn)定性的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系 統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了同時(shí)檢測(cè)人全血中VA、25OHVD2、25OHVD3、VE和 VK1濃度，本方法可對(duì)人全血中脂溶性維生素進(jìn)行快速的定性和定 量分析。該方法具有線性好、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，且每個(gè)樣本分析僅 需6.5 min，具有較高的分析通量。
 

來源：SCIEX中國公司